PL Przetwarzanie metanu do wybranych polihydroksyalkanianów z użyciem mikroorganizmów metanotroficznych

english

EN Environmental pollution and climate change caused by increased greenhouse gases (GHGs) emissions are the major concerns connected with the rapid growth of civilization. The prevalent use of fossil-based plastics, which resist degradation and whose production relies on non-renewable resources, highlights the need for biobased, biodegradable alternatives such as polyhydroxyalkanoates (PHA) produced by bacteria. PHAs can be produced from C1 GHG by methanotrophic bacteria utilising methane (CH4) as a low-cost and abundant carbon source. Under nutrient-limited conditions with CH4 as the sole carbon source, methanotrophs accumulate poly-3-hydroxybutyrate (PHB) as a carbon and energy storage. When specific compounds are added as a secondary carbon source during the accumulation, PHA copolymers with enhanced properties such as poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) can be produced. The efficiency of PHA production and the monomer composition of the final product depends on the bacterial strain used and the optimisation of key process conditions, such as pH, carbon availability, and medium composition. This thesis focused on the conversion of CH4 into selected PHAs with the use of methanotrophic bacteria. Its primary aim is to determine if a co-feeding strategy of precisely timed pulses of CH4 and secondary carbon source will result in the production of PHAs with defined composition in mixed methanotrophic microbial communities. A comprehensive study on the biotechnological potential of methanotrophic bacteria for CH4 conversion to valuable bioproducts was summarised in Chapter 2. This study identified the production of PHA, methanol, ectoine, and microbial protein as the most promising technologies for CH4 utilization bioprocesses, based on recent trends in CH4 bioconversion. The use of enriched mixed cultures was found to be a viable alternative to monocultures and the major challenges of low gas-liquid mass transfer on the bioprocess applicability was pointed out. Conducted literature analysis showcased the limited availability of data on the PHA copolymer production by mixed methanotrophic cultures which was addressed in this thesis. To investigate the PHA production from CH4 by mixed culture, at first, the PHB production potential of mixed methanotrophic cultures enriched from various environmental sources was compared in Chapter 3. In addition, the effect of the nitrogen source during the enrichment was evaluated, showing that nitrate promotes culture growth and PHB productivity more than ammonium. Among the enriched cultures the ones abundant in Methylocystis sp. exhibit the highest PHB accumulation (up to 27% PHB in dry cell weight (DCW)). Furthermore, the PHBV accumulation capacity of enriched cultures was studied with valeric acid as cosubstrate and under different CH4:O2 ratios in the headspace. At a 1:2 CH4:O2 ratio (10% CH4) an efficient CH4 oxidation was supported, and the cultures showed the highest biomass growth and PHA productivity. The possible participation of PHB-producing bacteria other than Methylocystis sp. was observed, and mixed culture enriched from waste-activated sludge and cultured at 10% CH4 (AS10 culture), with PHA accumulation of around 27% PHA in DCW and 39 mol% of 3-hydroxyvalerate (3HV) fraction, was designated as the most promising for application in CH4 to biopolymer conversion technologies. In Chapter 4, the use of different alcohols and organic acids as cosubstrate on PHA accumulation was evaluated. The addition of odd-carbon alcohols and acids results in the synthesis of PHBV with differed 3HV fraction, at the same time the use of C3-C6 fatty acids as cosubstrates increases the PHA accumulation. Valeric acid as the most optimal cosubstrate for PHBV accumulation was applied to examine the time-based co-feeding strategy for PHA production under a feast-famine regime in a bioreactor. The AS10 culture could produce and maintain PHA for most of the one-month process duration, however, the manipulation of the PHA composition through the changes in the cosubstrate feeding time proved to be unfeasible. Rather valeric acid utilisation for 3HV was dependent on the CH4 supply conditions with a higher 3HV fraction of 60 mol% accumulated at lower gas flow (0.1 standard litre per minute (slpm)) and 40 mol% at 0.2 slpm. The process operation without pH control caused a shift in the microbial composition due to the pH increase, impacting the PHA accumulation capacity. The maximum biomass and PHA concentration of 2.25 g/L and 0.5 g/L, respectively was achieved under pH controlled process. As gas supply to the reactor was observed to affect cosubstrate utilization and the incorporation of the 3HV monomer, a higher CH4 supply to the reactor was provided to study the effect of cosubstrate concentration on PHBV accumulation in a fed-batch system. In Chapter 5, pure and mixed methanotrophic cultures were compared for PHBV production under two cosubstrate feeding rates. The results showed that a mixed culture enriched in Methylocystis hirsuta was as effective for PHBV production as a pure M. hirsuta culture. At low valerate feeding, both cultures produced similar amounts of PHA (up to 0.67-0.71 g/L) with the mixed culture having a higher 3HV fraction (27 mol%) compared to the pure culture (20 mol%). A higher valerate feeding led to decreased PHA production but resulted in a higher 3HV fraction of around 40 mol% for both cultures. Analysis of the extracted polymers (Chapters 4 and 5) showed that PHAs with a molecular weight of 4.4-5.0 x 105 Da can be obtained from a mixed methanotrophic culture in a bioreactor. Chapter 6 summarises the main conclusions of this thesis and presents an outlook for future research and considerations for the development of biopolymer production from CH4 by mixed cultures.

PL Gwałtowny rozwój cywilizacji w ostatnich dekadach doprowadził do nasilenia się problemów związanych z zanieczyszczeniem środowiska i zmianami klimatycznymi spowodowanymi zwiększoną emisją gazów cieplarnianych. Rozpowszechnione wykorzystanie plastiku, który nie rozkłada się w środowisku naturalnym, wiążę się z problemem kontrolowania jego utylizacji i przedostawania się do środowiska. Dodatkowo znaczna większość produkowanego plastiku wykorzystuje nieodnawialne źródła kopalne co wraz z problemem zanieczyszczenia środowiska podkreśla potrzebę na pozyskiwanie biodegradowalnych alternatyw takich jak polihydroksyalkaniany (PHA) produkowane przez bakterie. PHA mogą być produkowane ze źródeł odpadowych, w tym z gazów cieplarnianych takich jak metan (CH4) wykorzystując specjalne bakterie metanotroficzne zdolne do utylizacji CH4 jako głównego źródła węgla. W warunkach ograniczonej dostępności składników odżywczych, podczas gdy źródło węgla jest powszechnie dostępne, metanotrofy akumulują polihydroksymaślan (PHB) jako magazyn węgla i energii. Suplementacja na tym etapie hodowli bakteryjne dodatkowym źródłem węgla może prowadzić do produkcji kopolimerów PHA takich jak poli(3-hydroksymaślan-co-3-hydroksywalerynian) (PHBV), które charakteryzują się lepszymi właściwościami niż PHB. Wydajność produkcji PHA oraz jego skład monomerowy zależy od wykorzystywanego szczepu bakteryjnego oraz optymalizacji kluczowych warunków procesu, takich jak pH, dostępność węgla i skład pożywki. Niniejsza praca doktorska skupia się na badaniu konwersji CH4 do wybranych PHA z użyciem bakterii metanotroficznych. Głównym celem pracy było sprawdzenie, czy strategia współkarmienia oparta na precyzyjnym dozowaniu CH4 i dodatkowego źródła węgla będzie skutkowało produkcją PHA o określonym składzie przez mieszane społeczności mikroorganizmów metanotroficznych. Biotechnologiczny potencjał bakterii metanotroficznych do konwersji CH4 do cennych bioproduktów został kompleksowo zestawiony i podsumowany w Rozdziale 2. Zaobserwowane trendy w biokonwersji CH4 wskazały produkcję PHA, metanolu, ektoiny i białek pojedynczych komórek jako najbardziej obiecujące technologie biologicznego przetwarzania CH4. Zauważono, że zastosowanie wzbogaconych kultur mieszanych stanowi realną alternatywę dla monokultur i wskazano główne wyzwanie dla wydajności i komercjalizacji procesu jakim jest niewystarczające przenoszenie masy między fazami. Przeprowadzona analiza literatury wykazała ograniczoną dostępność danych na temat produkcji kopolimeru PHA przez mieszane kultury metanotroficzne, uzupełnienie tej luki w wiedzy stało się przedmiotem niniejszej pracy doktorskiej. W celu zbadania produkcji PHA z CH4 przez mieszaną kulturę pierwszym krokiem, przedstawionym w Rozdziale 3, było porównanie potencjału do produkcji PHB przez mieszane kultury metanotroficzne wzbogacone z różnych środowisk. Dodatkowo oceniono wpływ źródła azotu podczas wzbogacania, wykazując, że sole azotanowe bardziej sprzyjają wzrostowi biomasy i wydajności produkcji PHB niż sole amonowe. Spośród wzbogaconych kultur te obfitujące w Methylocystis sp. wykazują najwyższą akumulację PHB (do 27% PHB w suchej masie komórek (DCW - dry cel weight)). Ponadto zbadano zdolność wzbogaconych kultur do akumulacji PHBV w różnych stężeniach CH4 i wykorzystując kwas walerianowy jako kosubstrat. Przy stosunku CH4:O2 wynoszącym 1:2 (10% CH4) wspomagane było efektywne utlenianie CH4, a kultury wykazywały największy wzrost biomasy i wydajność produkcji PHA. Zaobserwowano możliwą obecność bakterii produkujących PHB innych niż Methylocystis sp., a mieszana kultura wzbogacona z osadu czynnego i hodowana przy 10% CH4 (kultura AS10), z akumulacją PHA na poziomie około 27% PHA w DCW i frakcją 3-hydroksywalerianu (3HV) wynoszącą 39 mol%, została uznana za najbardziej obiecującą do zastosowania w technologiach konwersji CH4 do biopolimerów. W Rozdziale 4 oceniono zastosowanie różnych alkoholi i kwasów organicznych jako kosubstratu w akumulacji PHA. Zauważono, że dodanie alkoholi i kwasów o nieparzystej liczbie atomów węgla skutkuje syntezą PHBV o różnych frakcjach 3HV, jednocześnie stosowanie kwasów tłuszczowych C3-C6 zwiększa akumulację PHA. Kwas walerianowy, jako najbardziej optymalny kosubstrat do akumulacji PHBV, zastosowano do zbadania opartej na czasie dozowania strategii współkarmienia w bioreaktorze operującym w cyklach feast-famine (okresowego odżywiania i głodzenia hodowli). Kultura AS10 wykazywała produkcję PHA przez większość trwania procesu, jednak manipulacja składem PHA poprzez zmiany czasu podawania kosubstratu okazała się niemożliwa. Wykorzystanie kwasu walerianowego do produkcji 3HV zależało bardziej od warunków dostarczania CH4, z wyższą frakcją 3HV wynoszącą 60 mol% akumulowaną przy niższym przepływie gazu (0,1 standardowego litra na minutę (slpm)) i 40 mol% przy 0,2 slpm. Prowadzenie procesu bez kontroli pH skutkowało zmianą w składzie społeczności mikroorganizmów spowodowanej wzrostem pH, co jednak nie wpłynęło na zdolność do akumulacji PHA. Maksymalne stężenie biomasy i PHA wynoszące odpowiednio 2,25 g/L i 0,5 g/L osiągnięto w procesie z kontrolą pH. Ponieważ zaobserwowano, że dopływ gazu do reaktora wpływa na wykorzystanie kosubstratu i frakcję 3HV, w celu zbadania wpływu stężenia kosubstratu na akumulację PHBV w systemie okresowym z zasilaniem (fed-batch) zapewniono wyższe zasilanie CH4 do reaktora. W Rozdziale 5 porównano czyste i mieszane kultury metanotroficzne pod kątem produkcji PHBV przy dwóch stosunkach podaży kosubstratu. Mieszana kultura wzbogacona w Methylocytsis hirsuta była tak samo efektywna w produkcji PHBV jak czysta kultura M. hirsuta. Przy niskiej podaży walerianu, obie kultury produkowały podobne ilości PHA (do 0,67-0,71 g/L), przy czym mieszana kultura miała wyższą frakcję 3HV (27 mol%) w porównaniu do czystej kultury (20 mol%). Wyższe stężenia wprowadzanego walerianu prowadziły do zmniejszenia produkcji PHA, ale skutkowało wyższą frakcją 3HV wynoszącą około 40 mol% dla obu kultur. Analiza otrzymanych polimerów (Rozdziały 4 i 5) wykazała, że z mieszanej kultury metanotroficznej w bioreaktorze można uzyskać PHA o masie cząsteczkowej 4,4-5,0 x 105 Da. Rozdział 6 podsumowuje główne wnioski pracy doktorskiej oraz przedstawia perspektywy przyszłych badań i rozważania dotyczące rozwoju produkcji biopolimerów z CH4 przez mieszane kultury.

162

environmental engineering, mining and energy

no permission to download file

archive

Andrzej Białowiec

Wroclaw, Poland

10.09.2024

english

no permission to download file

archive

Raul Muñoz Torre

15.09.2024

english

no permission to download file

archive

Anna Pytlak

Lublin, Poland

06.09.2024

english

no permission to download file

archive

dissertation

Poznań, Polska

18.10.2024

Rada Dyscypliny Inżynieria Środowiska, Górnictwo i Energetyka Politechniki Poznańskiej

doktora nauk inżynieryjno-technicznych w dyscyplinie: inżynieria środowiska, górnictwo i energetyka